細說菜花的檢驗與分析

一般典型的菜花可視病灶的狀況，由目視辨認，但有疑慮時，仍需靠檢驗分析

有以下多種的菜花確診方法，以病理切片後的檢查才能百分之百確定為HPV 感染，尤以用PCR方法檢測HPV比核酸雜交方法優越。其敏感性高，檢測HPV實驗周期短、簡便快速。
以下：
一、醋酸白試驗（假陽性較常見）

　　用3-5%醋酸外塗疣體2-5分鐘，病竈部位變白稍隆起，肛門病損可能需要15分鐘。本試驗的原理是蛋白質與酸凝固變白的結果，HPV感染細胞產生的角蛋白與正常的未感染上皮細胞產生的不同，只有前者才能被醋酸脫色。醋酸白試驗檢測HPV的敏感性很高，它比常規檢測觀察組織學變化還好。但偶爾在上皮增厚或外傷擦破病例中出現假陽性、假陽性變白跡象顯得界限不清和不規則。美國CDC提示，醋酸白試驗並不是特異試驗，且假陽性較常見。

　　二、免疫組織學檢查

　　常用過氧化物酶抗過氧化物酶方法（即PAP），顯示濕疣內的病毒蛋白，以證明疣損害中有病毒抗原。HPV蛋白陽性時，尖銳濕疣的淺表上皮細胞內可出現淡紅色的弱陽性反應。
　
　　三、組織化學檢查

　　取少量病損組織制成塗片，用特異抗人類乳頭瘤病毒的抗體作染色。如病損中有病毒抗原，則抗原抗體結合。在過氧化物酶抗過氧化物酶（PAP）方法中，核可被染成紅色。此法特異性強且較迅速，對診斷有幫助。
　
　　四、病理檢查

　　主要為角化不全，棘層高度肥厚，乳頭瘤樣增生，表皮突增厚，延長，其增生程度可似假性上皮瘤樣。刺細胞和基底細胞並有相當數量的核分裂、頗似癌變。但細胞排列規則，且增生上皮和真皮之間界限清楚。其特點為粒層和刺層上部細胞有明顯的空泡形成。此種空泡細胞較正常大，胞漿著色淡、中央有大而圓，深嗜堿性的核。通常真皮水腫、毛細血管擴張以及周圍較致密的慢性炎性浸潤。Bushke-loewenstein巨大型尖銳濕疣，表皮極度向下生長，代替了其下面的組織、易與鱗狀細胞相混，故須多次活檢。若有緩慢發展之傾向， 則為一種低度惡變的過程，即所謂疣狀癌。

　　五、基因診斷

　　迄今，HPV難於用傳統的病毒培養及血清學技術檢測，主要實驗診斷技術是核酸雜交。近年來發展的PCR方法具有特異、敏感、簡便、快速等優點，為HPV檢測開辟了新途徑。 　　（一）標本的采集及處理

　　1．標本的采集和預處理：用刮板或生理鹽水浸潤的棉棒從陰道和宮頸外口取分泌物和細胞。在作細胞學檢查的同時，將標本放入5ml含有0.05%硫柳汞的PBS中，用PBS離心（3000g，10min）洗滌2次，沈積細胞重懸於1mlPBS中，取0.5ml細胞懸液抽提DNA。

　　2．標本核酸的提取：按1體積細胞懸液加10倍體積的細胞裂解液（10mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，10mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，0.4%SDS，1.0mg/ml蛋白酶K）37℃下處理過夜;且等體積酚/氯仿(1:1)，氯仿/異戊醇（24:1）各抽提2次；加1/10體積3mol/L NaAc（pH 5.2）及2.5倍體積無水乙醇置-20℃ 2h或過夜沈澱DNA；加1體積乙醇洗滌1次；用60μl含RNA酶(100μg/ml)的TE液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1.0mmol/L EDTA)溶解DNA，37℃溫育30min。

　　（二）PCR擴增

　　1． 引物設計和合成：HPV基因組可分為早期區（E）和晚期區（L），每區含一系列開放讀碼框架（ORF）。序列分析表明，各型HPV的非編碼區及E1、E6、E7和L1區均有保守序列。Manos等從HPVL1區中選擇保守序列設計合成引物MY11和MY09見表1，該引物與HPV 6、11、16、18及33型有互補序列，也可擴增其它型HPV。

　　Manos等設計的HPVL1通用引物

　　MY11：GCMCAGGGWCATAAYAATGG

　　MY09：CGTCCMARRGGAWACTGATC

　　2．PCR反應試劑：Taq DNA聚合酶（2U/ml）、10mmol/L dNTP貯備液（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol/L），10×PCR緩沖液(500mmol KCl、40mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris-HCl、pH 8.5)，100μmol/L MY11和MY09貯備液，滅菌的玻璃蒸餾器制備的蒸餾水。

　　3．PCR擴增方法和程序：以100μl PCR反應液,用無菌0.5ml矽化塑料離心管為反應管進行擴增反應。

　　（1）實驗前配制預混反應試劑並分裝。預混反應試劑包括除標本DNA外的其它各種PCR反應試劑。每支反應管中含有的PCR反應試劑見表3。

　　（2）各反應管依次加入10μl標本和90μl預混反應試劑。

　　（3）加入80-100μl石蠟油，在臺式離心機上快速離心數秒鐘，使各反應試劑收集於油層下。目前，PCR試劑已商品化，反應體積為25μl。使用時只加入標本DNA即可。

　　（4）將反應管置PCR擴增儀上，循環參數為95℃ 30s，55℃ 40s，72℃ 50s循環35次，最後72℃延伸5min。 　　4．每次試驗應設陽性及陰性對照。以載有HPV的重組質粒（每反應為100pg）或含有HPV的細胞系（如Caski、HeLa）DNA為陽性對照，以無HPV的人細胞系DNA為陰性對照。
　　
　　（三）擴增產物的檢測和分析

　　1． 凝膠電泳：擴增反應結束後，取出反應管，冷卻至室溫，取10μl擴增產物用5%-7%聚丙烯酰胺凝膠或1.5%瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色，紫外分析儀下分析結果，分子量約為450bp處出現明顯的DNA帶。

　　2． 核酸雜交：如果凝膠電泳無清楚的DNA或需確定DNA帶的特異性時，可用標記的公用混合探針和（或）型特異探針作Southern吸印雜交、斑點雜交驗證。 　　按照標準方法制32P ATP標記的寡核苷酸探針，需達到約107cpm/pmol特異活性。雜交液中需含有2×106-5×106cpm探針/ml。在55℃緩慢振蕩下雜交2-3h，隨後於30-55℃下用洗滌液（2×SSC、0.1%SDS）迅速沖洗雜交膜，除去多余探針。然後進行洗膜，其條件依所用探針而異：公用混合探針，55℃洗膜10min；MY12、MY13及MY16探針，56-57℃下10 min，並換液重洗1次；MY14及WD74探針，58-59℃下10min，亦換液重洗1次。
　　
　　用PCR方法檢測HPV比核酸雜交方法優越。其敏感性高，GP-PCR方法以凝膠電泳直接分析結果，可檢出標本中200個拷貝的HPV DNA，若以核酸雜交檢測PCR產物，敏感性提高，能檢出10個拷貝的HPV DNA。

　　鑒於PCR技術的高度敏感性，以生殖道脫落細胞為檢材足以滿足試驗要求，避免了活檢取材、研磨組織繁雜操作。一般情況下，PCR擴增產物經凝膠電泳，觀察產生的DNA可直接作出診斷。因此，PCR技術檢測HPV實驗周期短、簡便快速。